蛋白質(zhì)凝膠電泳凝膠的制備方法

        【材料與試劑】
         (1) 30%丙烯酰胺：稱取29g丙烯酰胺、1g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和60ml溫去離子水，加熱至37℃溶解，加水至終體積100ml，過濾，然后制備30%（w /v) 丙烯酰胺儲存溶液。丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在儲存過程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸。這種脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。因此，溶液的pH值不應(yīng)超過7.0，并應(yīng)在4°C下儲存在棕色瓶中。
         (2) 10%十二烷基硫鈉(SDS)：稱取10g SDS，加入去離子水90ml，加熱至68℃，加幾滴濃鹽酸調(diào)至pH7.2，加水至100ml，即 10% (W/v) SDS。
         (3)濃縮凝膠緩沖液(1mol/L Tris-HCl pH 6.8)：12.12g Tris溶于80ml去離子水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 6.8，再加入去離子水至100ml。儲存在 4°C。
         (4)分離凝膠緩沖液(1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8)：將18.16g Tris溶于80ml去離子水中，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，再加入去離子水至100ml。儲存在 4°C。
         (5) 10%過硫酸胺(AP)：過硫酸胺提供催化丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。少量 10% (W/V) 可用去離子水配制 保存溶液并在 4°C 下保存。由于過硫酸胺分解緩慢，應(yīng)每隔一周新鮮配制一次。
         (6) TEMED (N, N, N, N-四甲基乙二胺) TEMED通過催化過硫酸胺形成自由基來加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合。因?yàn)門EMED只能以游離的堿形式起作用，所以pH值低時(shí)聚合反應(yīng)受到抑制。
         (7) Tris-甘氨酸電泳緩沖液：分別稱取15.1g Tris和94g甘氨酸，溶于900ml去離子水中，再加入50ml 10%(w/v)SDS，再加入去離子水至1000ml變?yōu)??存儲解決方案。使用時(shí)稀釋5倍，Tris終濃度為25mmol/L，甘氨酸為250mmol/L，0.1% SDS，緩沖液pH為（8.3）。
         (8)聚丙烯酰胺凝膠電泳槽及電泳儀
        (9) 取樣器及吸頭等。
         【操作方法】
         (1) 按照立式電泳槽說明書安裝玻璃板，并確保配制分離凝膠的濃度和體積，按照《Tris-制備溶液》中所列組分配制所需的分離膠。甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠"（見書末附錄）；
         (2)將分離膠快速注入兩塊玻璃板之間的縫隙中，留出澆注膠合膠的空間（梳齒長度加1cm，用滴管小心地將分離膠蓋上一層0.1% SDS（丙烯酰胺濃度小于8%時(shí)）或異丁醇或水（丙烯酰胺濃度≥10%時(shí)），覆蓋層可以防止氧氣擴(kuò)散到凝膠中，抑制聚合反應(yīng)。室溫下垂直凝膠；
         (3)分離膠*聚合后，倒出覆蓋層液體，用去離子水多次沖洗凝膠頂部以去除未聚合的丙烯酰胺，盡可能去除凝膠上的液體；
         (4)確定要制備的濃縮膠體積，按“制備Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液"配制所需的濃縮膠，然后將濃縮膠直接倒在分離膠上，立即插入清潔配套梳子以避免氣泡，然后加入濃縮凝膠溶液以填充梳子之間的空間。濃縮凝膠聚合后，拔出梳子，形成樣品孔；
         (5)將Tris-甘氨酸電泳緩沖液用去離子水稀釋5倍，倒入電泳槽中，填滿樣品孔，此時(shí)樣品孔中的氣泡可通過電泳緩沖液消除。